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前言
基因功能研究中过表达我们常会涉及。相信做过表达多的伙伴们，ORF克隆过表达一定遇到过表达失败的结果，会有些令人沮丧吧，笔者借助基因功能研究领域服务累积的近15年的少许经验，这里分享一些关键细节给大家，期望能给大家少许帮助。
基因过表达效率影响因素
首先，基因过表达效率好坏因素比较复杂，主要在于以下4个因素：
1.基因本身性质
不同的基因在相同过表达质粒，相同的细胞，过表达存在巨大差异，类似我们WB做内参和目的蛋白一样，内参因为天然表达量大很好检测，而目的蛋白条带很多就很难检测（抛开抗体不好的因素），举个例子：如HSD3.8特异在睾丸组织中表达，一旦在其他细胞种类或者组织中，是无法检测到HSD3.8蛋白的，这个就是基因本身的性质问题。
总体来说：即使是同一个基因，过表达质粒也不变的情况下，在不同组织或者细胞中的过表达效率存在明显差异是很正常的。一般内源表达低的基因，相对容易做OverExpressing，高表达则相反。
2.质粒载体
不同过表达载体选择也会对基因的表达效率存在差异（如启动子类型，CMV会比较常见与通用，有些血液类的细胞需要特殊启动子如EF1a）。
如：目前最常用的pcDNA3.1(+)瞬转质粒，大部分基因可能都能适合过表达的，笔者曾经遇到pcDNA3.1(+)过表达做不出来，换了pLVX-puro的载体就正常能过表达了。
3.细胞类型
同一基因在不同细胞的过表达效率一定会有区别，主要在于不同细胞的转染效率存在天然差异与细胞内部调控机制的复杂差异，转染效率的差异比较好量化一些，下面简单以转染效率差异举例：
转染效率有明显差异会出现过表达效率的直观差异。
建议：（1）一般大家觉得293T比较好做过表达，个人觉得核心原因还是转染效率高（基本>70%），如细胞没有特殊要求的话，可优先选择。
（2）转染试剂效率的好坏也会对过表达效率有直接影响。
4.未知的细胞内部代偿机制
之前还偶有遇到比较诡异的过表达情况，mRNA水平上调极高，甚至到了上千倍，但蛋白水平上调不明显，这种情况不止一次遇到过，个人分析原因供参考：（1）过表达质粒导入后，转录的mRNA水平异常的高（如上调>1000倍），细胞内部系统可能有种机制检测到该基因的mRNA过度异常，启动快速降解机制快速降解了mRNA，让其不能正常翻译；（2）细胞内复杂的代偿通路，mRNA也可能已经正常翻译，但是通路的上下调机制，可能快速降解了异常高表达的目标蛋白。
综上所述，靠谱的提供过表达质粒的厂家都会说不能保证基因100%能过表达成功，因为影响因素比较多，不过也不用悲观，按照笔者的经验和数据，在293T细胞上做过表达，成功率>85%-90%，不同细胞只要能质粒感染或者转染效率好，整体来说过表达成功率还是比较高的。
但确实存在一些基因过表达不那么好做，一旦遇到，尝试将基因换到不同的质粒，转染不同的细胞来多测试一下，大多数情况也是能解决的。
供应商正常交付标准
表达克隆的供应商能保证的正常交付标准如下，不要过度期盼：
构建的基因只保证表达载体构建方案的合理性和构建载体的100%序列正确性，但是肯定是不能100%保证后续载体的蛋白过表达水平的实际效率与成功的。
这个点上不要过度期盼，不要相信不靠谱的公司或者销售的过度承诺，会保证蛋白水平效率啥的（很可能只是做了某个类似293T细胞的过表达验证，但是换了细胞可能就不行了），有时会希望越大，失望越大。
过表达不成功后的3点建议
1.查找该基因的相关文献，是否有成功做过的文章，参考所用的质粒，细胞，其实变成单纯的重复这个实验，这样成功率基本100%，很值得借鉴。
2.一旦出现过表达不成功，首先是基因性质上找找原因，大可不必把没有过表达成功的质粒，归结为公司构建的质粒水平不行（除非测序发现序列不对），基本可以调整的方向就是换下更好转染的细胞进行，另外换1-2不同类型的商业化过表达质粒来尝试。
3.保证好的转染效率：lipo2000与3000还是经过了市场检验的，其实转染试剂可选的很多，不要只图便宜，也不要只认贵的，市场上确实有性价比很高但转染效率很好的转染试剂，一定需要仔细的数据测试后再长期使用。
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