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本文主要针对Co-IP对照设置原因操作方式，旨在验证蛋白互作的严谨性与排除可能存在的问题。以下是Co-IP实验对照设置的完整方案设计，结合文献与实验经验整理。
01
必须设置的核心对照
01
Input组
▶目的：验证样本中靶蛋白和互作蛋白的存在，排除因蛋白降解导致的假阴性误判。
▶操作：取未进行IP的原始裂解液，直接通过Western Blot检测靶蛋白（如X）及互作蛋白（如Y）。
02
IgG同型对照
▶目的：排除抗体非特异性结合（如抗体与磁珠或杂蛋白的非目标结合）。
▶操作：使用与IP抗体同种属、同亚型的非特异性IgG（如小鼠IgG代替小鼠抗X抗体）进行平行实验。
03
空白磁珠对照
▶目的：验证磁珠是否吸附非特异性蛋白（如样本中高丰度蛋白或标签蛋白）。
▶操作：仅用磁珠孵育样本（不加抗体），检测是否沉淀出目标蛋白。
02
特殊实验条件下的补充对照
01
敲除/未处理样本对照
▶目的：排除背景信号干扰（如内源性蛋白残留或实验处理诱导的假互作）。
▶操作：在靶蛋白敲除的细胞系或未转染质粒的野生型细胞中进行相同实验。
02
阳性对照
▶目的：验证实验体系可靠性（如已知互作蛋白对的验证）。
▶操作：使用已知互作的蛋白对（如Myc-USP20与Flag-PKM26）进行共转染并检测互作信号。
03
反向验证组
▶目的：确认互作双向性（避免因表位遮蔽导致的假阴性）。
▶操作：分别用抗X抗体和抗Y抗体进行IP，验证双向互作（如抗X拉Y，抗Y拉X）。
03
对照设置的具体场景方案
场景1
外源性标签蛋白互作验证
实验组
共转染Flag-X和HA-Y质粒，用Flag抗体IP，检测HA-Y。
对照设置
▶Input组：验证Flag-X和HA-Y在裂解液中的表达。
▶IgG组：排除Flag抗体的非特异性结合。
▶单转染对照：分别转染Flag-X或HA-Y，确认互作非单体质粒污染导致。
场景2
内源性蛋白互作验证
实验组
用内源性抗X抗体IP，检测内源性Y蛋白。
对照设置：
▶敲除细胞对照：在X敲除细胞中进行相同实验，排除抗体交叉反应。
▶预纯化（Pre-clearing）：用空白磁珠预吸附样本，去除非特异性结合。
04
结果验证与优化策略
01
信号干扰排除
▶轻重链干扰
使用不同种属的一抗或纳米抗体。
▶高背景
增加洗涤次数（3-5次）或调整盐浓度（150-300 mM NaCl）。
02
多技术交叉验证
▶免疫荧光（IF）
验证蛋白共定位（排除体外人为结合）。
▶GST Pull-down
确认是否为直接互作。
05
操作建议
▶抗体选择：优先单克隆抗体（特异性高），避免使用WB验证但未经验证IP的抗体。
▶重复实验：至少3次生物学重复，确保结果一致性。
▶质谱辅助：对IP产物进行质谱分析，筛选特异性互作蛋白。
总结
对照设置需根据实验目的（内源/外源、直接/间接互作）动态调整。完整的对照方案应包含Input、IgG、空白磁珠、敲除/单转染对照，并结合反向验证及交叉实验技术（如IF、Pull-down）排除假阳性。若仍存在争议性结果，建议改用邻近标记技术（如BioID）进一步验证。
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